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当高效液相色谱常见问题分析与对策

发布时间:2021-09-14 23:05:17 阅读: 来源:清水泵厂家

高效液相色谱常见问题分析与对策

液相色谱系统的许多问题都能在谱图上反映出来。其中有一些问题可以通过改变设备参数得到解决;而其他的问题必须通过修改操作程序来解决。对于色谱柱和流动相的正确选择是得到好的色谱图的关键。

A、峰拖尾

原 因

解决方法

1、筛板阻塞

a、反冲色谱柱 b、更换进口筛板 c、更换色谱柱

2、色谱柱塌陷

填充色谱柱

3、干扰峰

a、使用更长的色谱柱 b、改变流动相或更换色谱柱

4、流动相PH选择错误

调整PH值。对于碱性化合物,低PH值更有利于得到对称峰

5、样品与填料表面的溶化点发生反应

a、加入离子对试剂或碱性挥发性修饰剂b、更改色谱柱

B、峰前延

原 因

解决方法

1、柱温低

升高柱温

2、样品溶剂选择不恰当

使用流动相作为样品溶剂

3、样品过载

降低样品含量

4、色谱柱损坏

见A1、A2

C、峰分叉

原 因

解决方法

1、保护柱或分析柱污染

取下保护柱再进行分析。如果必要更换保护柱。如果分析柱阻塞,拆下来清洗。如果问题仍然存在,可能是柱子被强保留物质污染,运用适当的再生措施。如果问题仍然存在,入口可能被阻塞,更换筛板或更换色谱柱。

2、样品溶剂不溶于流动相

改变样品溶剂。如果可能采取流动相作为样品溶剂。

D、峰变形

原 因

解决方法

1、样品过载

减少样品载量

E、早出的峰变形

原 因

解决方法

1、样品溶剂选择不恰当

a、减少进样体积 b、运用低极性样品溶剂

F、早出的峰拖尾程度大于晚出的峰

原 因

解决方法

1、柱外效应

<用户可以尝试着试试其他的按键如速度、返回、清零、校准等等其他按键查看其是不是有反应p>a、调整系统连接(使用更短、内径更小的管路)

b、使用小体积的流通池

G、K’增加时,脱尾更严重

原 因

解决方法

1、二级保留效应,反相模式

a、加入三乙胺(或碱性样品) b、加入乙酸(或酸性样品) c、加入盐或缓冲剂(或离子化样品) d、更换一支柱子

2、二级保留效应,正相模式

a、加入三乙胺(或碱性样品) b、加入乙酸(或酸性样品) c、加入水(或多官能团化合物) d、试用另一种方法

3、二级保留效应,离子对

加入三乙胺(或碱性样品)

H、酸性或碱性化合物的峰拖尾

原 因

解决方法

1、缓冲不合适

a、使用浓度mM的缓冲液 b、使用Pka等于流动相PH值的缓冲液

I、额外的峰

原 因

解决方法

1、样品中有其他组份

正常

2、前一次进样的洗脱峰

a、增加运行时间或梯度斜率 b、提高流速

3、空位或鬼峰

a、检查流动相是否纯净 b、使用流动相作为样品溶剂 c、减少进样体积

J、保留时间波动

原 因

解决方法

1、温控不当

调好柱温

2、流动相组分变化

防止变化(蒸发、反应等)

3、色谱柱没有平衡

在每一次运行之前给予足够的时间平衡色谱柱

K、保留时间不断变化

原 因

解决方法

1、流速变化

重新设定流速

2、泵中有气泡

从泵中除去气泡

3、流动相选择不恰当

a、更换合适的流动相 b、选择合适的混合流动相

L、基线漂移

原 因

解决方法

1、柱温波动。(即使是很小的温度变化都会引起基线的波动。通常影响示差检测器、电导检测器、较低灵敏度的紫外检测器或其它光电类检测器。)

控制好柱子和流动相的温度,在检测器之前使用热交换器图

2、流动相不均匀。(流动相条件变化引起的基线漂移大于温度导致的漂移。)

使用HPLC级的溶剂,高纯度的盐和添加剂。流动相在使用前进行脱气,使用中使用氦气。

3、流通池被污染或有气体

用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池。如有需要,可以用1N的硝酸。(不要用盐酸)

4、检测器出口同时还可以采取应变或其他更先进的测试方法阻塞。(高压造成流通池窗口破裂,产生噪音基线)

取出阻塞物或更换管子。参考检测器手册更换流通池窗。

5、流动相配比不当或流速变化

更改配比或流速。为避免这个问题可定期检查流动相组成及流速。

6、柱平衡慢,特别是流动相发生变化时

用中等强度的溶剂进行冲洗,更改流动相时,在分析前用倍体积的新流动相对柱子进行冲洗。

7、流动相污染、变质或由低品质溶剂配成

检查流动相的组成。使用高品质的化学试剂及HPLC级的溶剂

8、样品中有强保留的物质(高K’值)以馒头峰样被洗脱出,从而表现出一个逐步升高的基线。

使用保护柱,如有必要,在进样之间或在分析过程中,定期用强溶剂冲洗柱子。

9、使用循环溶剂,但检测器未调整。

重新设定基线。当检测器动力学范围发生变化时,使用新的流动相。

10、检测器没有设定在最大吸收波长处。

将波长调整至最大吸收波长处

M、基线噪音(规则的)

原 因

解决方法

1、在流动相、检测器或泵中有空气

流动相脱气。冲洗系统以除去检测器或泵中的空气。

2、漏液

见第三部分。检查管路接头是否松动,泵是否漏液,是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要,更换泵密封。

3、流动相混合不完全

用手摇动使混合均匀或使用低粘度的溶剂

4、温度影响(柱温过高,检测器未加热)

减少差异或加上热交换器

5、在同一条线上有其他电子设备

断开LC、检测器和记录仪,检查干扰是否来自于外部,加以更正。

6、泵振动

在系统中加入脉冲阻尼器

N、基线噪音(不规则的)

原 因

解决方法

1、漏液

见第三部分。检查接头是否松动,泵是否漏液,是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要,更换密封。检查流通池是否漏液。

2、流动相污染、变质或由低质溶剂配成

检查流动相的组成。

3、流动相各溶剂不相溶

选择互溶的流动相

4、检测器/记录仪电子元件的问题

断开检测器和记录仪的电源,检查并更正。

5、系统内有气泡

用强极性溶液清洗系统

6、检测器内有气泡

清洗检测器,在检测器后面安装背景压力调节器

7、流通池污染(即使是极少的污染物也会产生噪音。)

用1N的硝酸(不能用磷酸)清洗流通池

8、检测器灯能量不足

更换灯

9、色谱柱填料流失或阻塞

更换色谱柱

10、流动相混合不均匀或混合器工作不正常

维修或更换混合器,在流动相不走梯度时,建议不使用泵的混合装置

O、宽峰

原 因

解决方法

1、流动相组成变化

重新制备新的流动相

2、流动相流速太低

调节流速

3、漏液(特别是在柱子和检测器之间)

见section 3。检查接头是否松动、泵是否漏液、是否有盐析出以及不正常的噪音。如果必要更换密封。

4、检测器设定不正确

调整设定

5、柱外效应影响

a、 柱子过载b、检测器对反应时间或池体积响应过大c、柱子与检测器之间的管路太长或管路内径太大d、记录仪响应时间太长 5、 a、 小体积进样(例如:10ul而不是100ul)以1:10或1:100的比例稀释样品b、 减少响应时间或使用更小的流通池c、 使用内径为0..01的短管路d、 减少响应时间

6、缓冲液浓度太低

增加浓度

7、保护柱污染或失效

更换保护柱

8、色谱柱污染或失效,塔板数较低

更换同样类型的色谱柱。如果新柱子可以提供对称的色谱峰,则用强溶剂冲洗旧柱子。

9、柱入口塌陷

打开柱入口,填补塌陷或更换柱子

10、呈现两个或多个未被完全分离的物质的峰

选择其它类型的色谱柱以改善分离效果

11、柱温过低

提高柱温。除非特殊情况,温度不宜超过75℃

12、检测器时间常数太大

使用较小的时间常数

P、分离度降低

原 因

解决方法

1、流动相污染或变质(引起保留时间变化)

重新配置流动相

2、保护柱或分析柱阻塞图

去掉保护柱进行分析。如果必要则更换保护柱。如果分析柱阻塞,可进行反冲。如果问题仍然存在色谱柱可能被强保留的污染物损坏,建议使用恰当的再生程序。如果问题仍然存在,进口可能阻塞了,更换入口处的筛板或因浇口固化早而使收缩率仍较大更换色谱柱。

Q、所有的峰面积都太小

原 因

解决方法

1、检测器衰减设定过高

减少衰减的设定

2、检测器时间常数设定太大

设定较小的时间常数

3、进样量太少

增大进样量

4、记录仪连接不当

使用正确的连接

R、所有的峰面积都太大

原 因

解决方法

1、检测器衰减设定过低

采取较大的衰减

2、进样过多

减少进样量

3、记录仪连接不正确

正确连接记录仪

高效液相色谱常见故障的断定及解决

诊状 可能的原因 解 决 方 法

(一)保留时间变化

1.柱温变化 柱恒温,必要时需配置恒温箱

2.等度与梯度间未能充分平衡 至少用10倍柱体积的流动相平衡柱

3.缓冲液容量不够 用 25mmol/L的缓冲液

4.柱污染 每天冲洗柱

5.柱内条件变化 稳定进样条件,调节流动相

6.柱快达到寿命 采用保护柱

(二)保留时间缩短

1.流速增加 检查泵,重新设定流速

2.样品超载 降低样品量

3.键合相流失 流动相PH值保持在3~7.5检查柱的方向

4.流动相组成变化 防止流动相蒸发或沉淀

5.温度增加 柱恒温

(三)保留时间延长

1.流速下降 管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡

2.硅胶柱上活性点变化 用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化柱

3.键合相流失 同前(二)3

4.流动相组成变化 同前(二)4

5.温度降低 同前(二)5

(四) 出现肩峰或分叉

1.样品体积过大 用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15%

2.样品溶剂过强 采用较弱的样品溶剂

3.柱塌陷或形成短路通道 更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件

4.柱内烧结不锈钢失效 更换烧结不锈钢,加过滤器,过滤样品

5.进样器损坏 更换进样器转子

(五)鬼峰

1.进样阀残余峰 每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗

2.样品中未知物 处理样品

3.柱未平衡 重新平衡柱,用流动相作样品溶剂 (尤其是离子对色谱)

4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽谱) 每天新配,用抗氧化剂

5.水污染(反相) 通过变化平衡时间检查水质量,用HPLC级的水

(六) 基线噪声

1.气泡(尖锐峰) 流动相脱气,加柱后背压

2.污染(随机噪声) 清洗柱,净化样品,用HPLC级试剂

3.检测器灯连续噪声 更换氘灯

4.电干扰(偶然噪声) 采用稳压电源,检查干扰的来源(如水浴等)

5.检测器中有气泡 流动相脱气,加柱后背压

(七)峰拖尾

1.柱超载 降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相

2.峰干扰 清洁样品,调整流动相

3.硅羟基作用 加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相PH值,钝化样品

4.同前(四)4 同前(四)4

5.同前(四)3 5.同前(四)3

6.死体积或柱外体积过大 连接点降至最低,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内径的连接管

7.柱效下降 用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱

(八)峰展宽

1.进样体积过大 同(四)1

2.在进样阀中造成峰扩展 进样前后排出气泡以降低扩散

3.数据系统采样速率太慢 设定速率应是每峰大于10点

4.检测器时间常数过大 设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的10%

5.流动相粘度过高 增加柱温,采用低粘度流动相

6.检测池体积过大 用小体积池,卸下热交换器

7.保留时间过长 等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱

8.柱外体积过大 将连接管径和连接管长度降至最小

9.样品过载 进小浓度小体积样品

高效液相色谱常见故障的判定及解决方法总汇(二)

12、检测器时间常数太大 12、使用较小的时间常数

P、 分离度降低

原 因 解决方法

1、流动相污染或变质(引起保留时间变化) 1、重新配置流动相

2、保护柱或分析柱阻塞图 2、去掉保护柱进行分析。如果必要则更换保护柱。如果分析柱阻塞,可进行反冲。如果问题仍然存在色谱柱可能被强保留的污染物损坏,建议使用恰当的再生程序。如果问题仍然存在,进口可能阻塞了,更换入口处的筛板或更换色谱柱。

Q、 所有的峰面积都太小

原 因 解决方法

1、检测器衰减设定过高 1、减少衰减的设定

2、检测器时间常数设定太大 2、设定较小的时间常数

3、进样量太少 3、增大进样量

4、记录仪连接不当 4、使用正确的连接

R、 所有的峰面积都太大

原 因 解决方法

1、检测器衰减设定过低 1、采取较大的衰减

2、进样过多 2、减少进样量

3、记录仪连接不正确 3、正确连接记录仪

以下问题在使用进样阀过程中有可能发生。

A、 手动进样阀,转动不灵

原 因 解决方法

1、转子密封损坏 1、更换或调整转子密封

2、转子太紧 2、调整转子的松紧度

B、 手动进样阀,载样困难

原 因 解决方法

1、进日前构成了新的《鼓励外商投资产业目录》征求意见稿样阀安装不当 1、重新安装

2、定量环阻塞 2、清洗或更换定量环

3、进样器污染 3、清洗或更换进样器

4、管路阻塞 4、清洗或更换管路

C、 自动进样阀,不能转动

原 因 解决方法

1、无压力(或电源) 1、提供恰当的压力(电源)

2、转子太紧 2、调整转子的松紧度

3、进样阀安装不当 3、重新安装

D、 自动进样阀,其它问题

原 因 解决方法

1、阻塞 1、清洗或更换阻塞部件

2、机械故障 2、见随机维修手册

3、控制器故障 3、维修或更换控制器

由气味、景象和声音可以发现的问题

你需要运用你所有的感官去发现液相色谱的问题。你最好养成习惯,每天花上几分钟运用你的感官(除了味觉)来“感觉”你的液相色谱是否存在问题,这样可以帮助你迅速找到问题所在。例如:在你看到漏液之前,你可能首先闻到它的气味。大部分的问题是可以通过眼睛看到。

A、 溶剂的气味

原 因 解决方法

1、漏液 1、见section 3

2、溅出 2、a、检查废液瓶是否已满 b、找到溅出的部位并清洗干净

B、 热气味

原 因 解决方法

1、仪器过热 1、a、检查并调节通风设施 b、检查并调节温度设定 c、关掉仪器,查找维修手册

C、 读数不正常

原 因 解决方法

1、压力不正常 1、见section 2

2、柱温箱问题 2、a、检查并调节设定b、参照用户手册

3、检测器灯失效 3、更换灯

D、 灯警告

原 因 解决方法

1、压力超出极限值 1、a、检查是否阻塞b、检查并调节极限值的设定

2、其它警示灯 2、见用户手册

E、 警告音

原 因 解决方法

1、溶剂泄漏/溅出 1、找到并解决

2、其它警告音 2、见用户手册

F、 刺耳的短音或长音

原 因 解决方法

1、轴承失效 1、见用户手册

2、润滑不够 2、进行恰当的润滑

3、机械故障 3、见用户手册

由气味、景象和声音可以发现的问题

你需要运用你所有的感官去发现液相色谱的问题。你最好养成习惯,每天花上几分钟运用你的感官(除了味觉)来“感觉”你的液相色谱是否存在问题,这样可以帮助你迅速找到问题所在。例如:在你看到漏液之前,你可能首先闻到它的气味。大部分的问题是可以通过眼睛看到。

A、 溶剂的气味

原 因 解决方法

1、漏液 1、见section 3

2、溅出 2、a、检查废液瓶是否已满 b、找到溅出的部位并清洗干净

B、 热气味

原 因 解决方法

1、仪器过热 1、a、检查并调节通风设施 b、检查并调节温度设定 c、关掉仪器,查找维修手册

C、 读数不正常

原 因 解决方法

1、压力不正常 1、见section 2

2、柱温箱问题 2、a、检查并调节设定b、参照用户手册

3、检测器灯失效 3、更换灯

D、 灯警告

原 因 解决方法

1、压力超出极限值 1、a、检查是否阻塞b、检查并调节极限值的设定

2、其它警示灯 2、见用户手册

E、 警告音

原 因 解决方法

1、溶剂泄漏/溅出 1、找到并解决

2、其它警告音 2、见用户手册

F、 刺耳的短音或长音

原 因 解决方法

1、轴承失效 1、见用户手册

2、润滑不够 2、进行恰当的润滑

3、机械故障 3、见用户手册

常见故障及日常维护

下表中列出了液相色谱常见的一些问题,右侧中则列出的日常维护的方法可以减少问题出现的频率。括号中的数字是建议进行维护的时间间隔。用户手册则提供您更多的维护方法。

溶剂瓶

问 题 维 护

1、进口筛板阻塞 1、a、更换(个月)b、过滤流动相,0.5u滤膜

2、气泡 2、流动相脱气

问 题 维 护

1、气泡 1、流动相脱气

2、泵密封损坏 2、更换(3个月)

3、单向阀损坏 3、过滤流动相,运用过滤,准备备用单向阀

进样阀

问 题 维 护

1、转子密封损坏 1、a、不要拧的过紧b、过滤样品

色谱柱

问 题 维 护

1、筛板阻塞 1、a、过滤流动相 b、过滤样品 c、运用过滤或保护柱

2、柱头塌陷 2、a、避免使用PH 8的流动相(针对大部分硅胶的柱子) b、使用保护柱 c、使用预柱(饱和色谱柱)

检测器

问 题 维 护

1、灯失效,检测器响应降低,噪音增大 1、更换(6个月)或准备备用灯

2、流通池有气泡 2、a、保持流通池清洁 b、池后使用反压抑制器 c、流动相脱气

一般

问 题 维 护

1、腐蚀/摩擦损坏 1、在不使用时保持系统缓冲液的清洁

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